Yeni damar oluşumu olarak tanımlanan neovaskülarizasyon, tümör büyümesi ve metastazı için gereklidir^2,3. Vaskülarize olmadığı takdirde tümör birkaç milimetreden daha fazla büyüyemez. Tümör vaskülaritesi ve prognoz arasındaki ilişki çok sayıda solid tümörde araştırılmıştır. Yeni damar oluşumunda anjiyogenik sitokinler, proteolitik enzimler, migratuar faktörler gibi farklı proteinlerin etkin rol aldığı düşünülmektedir. Bunlar tümör hücreleri dahil endotel hücreleri, fibroblastlar ve tümör komşuluğundaki makrofajlar tarafından salgılanabilmektedir⁴. Tümör çevresindeki makrofajlar, mononükleer fagositer sisteme dahil hücrelerdir ve tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α ), nitrik oksit (NO), hidrojen peroksit (H₂O₂) gibi sitokinlerle tümör hücresine karşı direkt sitotoksik etki gösterebilmektedirler^5,6. Makrofajlar ayrıca vasküler endoteliyal büyüme faktörü (VEGF), TNF- α, anjiyogenin, ürokinaz, fibroblast büyüme faktörü (bFGF) gibi anjiyogenezi stimüle eden çeşitli faktörler salgılayabilmektedir^7-9. Makrofajlar tüm bunlara ek olarak IL-12 ve IL-18 gibi sitokinler salgılayarak immün sistemi stimüle edebilmektedir^5,6.

NK hücreleri kemik iliğinden köken alan lenfositler olup, viral ve mikrobiyal enfeksiyonların immün cevabında ve tümör immünitesinde etkileri olan hücrelerdir. NK hücreleri ile makrofajların, immün cevapta yer yer çakışan etkileri olmaktadır¹⁰. Son yıllarda yapılan, NK hücreleri ile anjiyogenez arasındaki ilişkiyi araştıran çalışmalarda, NK hücrelerinin anjiyogenik faktörler salgıladığı öne sürülmektedir^11,12.

Eozinofil lökositlerin de özellikle allerjik hastalıklarda, anjiyogenezde rolü olduğunu iddia eden çalışmalar bulunmaktadır¹³. Eozinofil lökositlerin anjiyogenez dışında tümör immünitesinde etkileri olduğu, baş-boyun tümörleri, servikal ve rektal tümörleri de içeren bir grup kanser türünde gösterilmiştir^14-16.

Bu çalışmada amacımız tümör çevresindeki NK hücresi, makrofaj ve eozinofil lökositleri içeren inflamatuar hücre infiltrasyonunun, kolorektal karsinomlarda bilinen en önemli iki prognostik parametre olan lenf nodu metastazı ve invazyon derinliği ile ilişkisini araştırmaktır. Ayrıca inflamatuar hücrelerin, kendi aralarındaki ve tümör anjiyogenezi ile olan ilişkisi de araştırılmıştır.

İmmünreaktivitenin Değerlendirilmesi
Neovaskülarizasyon için Weidner’in¹⁸ tariflediği “hot spot” yöntemi uygulanmıştır. Peritümöral stromada CD31 ile işaretlenen damarları saptamak için, kesitler önce küçük büyütmede (x40) taranarak damardan yoğun dört alan belirlenmiş, ardından x200 büyütmede bu dört alandaki mikrodamarlar sayılarak ortalama damar yoğunluğu (MVD) hesaplanmıştır (Resim 1). CD68 ile işaretlenmiş makrofajlar, 5 büyük büyütme alanında (BBA) (x400) sayılarak ortalamaları alınmıştır (Resim 2). Aynı şekilde H-E kesitlerde, 5 BBA’da eozinofil lökositler sayılarak ortalamaları alınmıştır. CD56 ile sitoplazmik olarak pozitif boyanan NK hücreleri ise, x200 büyütmede 50 alan sayılarak toplamı alınmıştır (Resim ffigure3>3). Tüm inflamatuar hücre sayımları peritümöral stromada yapılmıştır.

Click Here to Zoom

Resim 1: Tümör stromasında CD31 ile işaretli mikrodamarlar (x400).

Click Here to Zoom

Resim 2: Peritümöral CD68 ile işaretli makrofajlar (x400).

Click Here to Zoom

Resim 3: Tümör çevresinde CD56 ile işaretli NK hücreleri (x400).

İstatiksel Analiz
İstatistiksel analizler SPSS (Scientific Package for Social Sciences) programı ile IBM uyumlu bilgisayarda yapıldı. Tüm verilerin tanımlayıcısı ve dağılımsal değerleri alındı. İstatistiksel analizde olgulara ait lezyonların invazyon derinliği, lenf nodu metastaz durumu, neovaskülarizasyon, peritümöral makrofaj, eozinofil lökosit ve NK hücresi infiltrasyonu değerlendirildi. İnvazyon derinliği ile, anjiyogenez ve inflamatuar hücreler arasındaki ilişkiye bakıldı. Aynı şekilde metastatik lenf nodu varlığı ile anjiyogenez ve inflamatuar hücreler arasındaki ilişkiye bakıldı. Ayrıca anjiyogenez ve inflamatuar hücreler arasındaki ilişkiler ve peritümöral inflamatuar hücrelerin kendi aralarındaki ilişkileri değerlendirildi. Sonuçlar ki-kare ve Pearson korelasyon testi kullanılarak elde edildi. Olasılık katsayısı (p), 0.005’e eşit ya da 0.005’den küçük ise istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Click Here to Zoom

Tablo 1: 75 Kolorektal karsinom vakasının klinik özellikleri

İnvazyon derinliğine göre vakaların 12’si (%16) T2, 50’si (%67) T3 ve 13’ü (%17) T4 tümör olarak gruplandırıldı.

İnvazyon derinliği ile neovaskülarizasyon, eozinofil lökosit, makrofaj ve NK hücresi sayısı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır. Bu ölçümlerin invazyon derinliklerine ait tanımlayıcı istatistikleri Tablo II’de verilmiştir. Aynı şekilde lenf nodu metastazı ile neovaskülarizasyon, eozinofil lökosit, makrofaj ve NK hücresi sayısı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır. Ancak invazyon derinliği ile, metastatik lenf nodu varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmuştur (p=0.05). Buna göre invazyon derinliği bakımından T2 grubunda olanların lenf nodu metastazı, T3 ve T4 grubunda olanlara oranla anlamlı düzeyde daha düşüktür (p=0.0039).

Click Here to Zoom

Tablo 2: İnvazyon derinliklerine göre tanımlayıcı veriler

Anjiyogenez ve inflamatuar hücreler arasındaki ilişkiyi değerlendirdiğimizde; neovaskülarizasyon arttıkça peritümöral makrofaj sayısının da anlamlı olarak arttığı gözlenirken (p=0.009), neovaskülarizasyon ile eozinofil lökosit arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmamıştır (p=0.961). Buna karşın neovaskülarizasyon arttıkça, NK hücresinin de arttığı gözlenirken aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0.067).

İnflamatuar hücrelerin kendi aralarındaki ilişkilere bakıldığında; makrofaj sayısı arttıkça NK hücre sayısının arttığı ve istatistiksel olarak anlamlı olduğu izlenirken (p=0.021), eozinofil lökositler ile arasında ilişki saptanmamıştır (p=0.103).

NK hücre sayısının artımıyla, eozinofil lökosit sayısının da anlamlı olarak arttığı izlenmiştir (p=0.027).

Olgularımızda makrofajlar daha çok anjiyogenezin yoğun olduğu peritumöral alanlarda saptanırken, NK hücrelerinin intratümöral yerleşimleri dikkat çekmiştir.

Anjiyogenez ve tümör çevresindeki inflamatuar hücrelere bakacak olursak; çalışmamızda tümör anjiyogenezi ile tümör çevresindeki makrofaj yoğunluğu arasındaki ilişkiyi anlamlı bulurken, aynı ilişkiyi eozinofil lökositler arasında gösteremedik. Yine NK hücreleri ile anjiyogenez arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulamasak da, anjiyogenez arttıkça NK hücre sayısının da arttığını gözlemledik. Makrofajlardan anjiyogenezi indükleyen çeşitli sitokinler salınır. TNF- α , VEGF, hipoksiye bağımlı faktör (HIF), FGF ve IL-8 bunlardan bazılarıdır^5-7,20-23. Aynı zamanda anjiyogenezi inhibe eden trombospondin- 1 (TSP-1), transforme edici büyüme faktörü (TGF- β ), IL-1 gibi faktörler de makrofajlar tarafından sentezlenebilmektedir⁶. Makrofajlardan salgılanan anjiyogenik faktörlerden biri olan TNF- α ’yı, eozinofil lökositler de içermektedir. Anjiyogenez ile eozinofil lökositler arasında ilişki saptayamamızın nedeni olarak, anjiyogenezi indükleyen olayların aslında çok karmaşık olduğu ve aktive-inhibe edici moleküllerin birbirleriyle dengede olması olabileceği düşünülmüştür.

Tümör çevresindeki makrofaj infiltrasyonu bazı tümörlerde anjiyogenez ve prognozla ilişkili bulunurken, bazılarında ilişki saptanmamıştır. Daha önce yaptığımız bir çalışmada, akciğerin küçük hücreli dışı karsinomlarında anjiyogenez ve tümör çevresi makrofajlar arasında da anlamlı ilişki saptamamıştık²⁴. Leek ile Takanami ve ark. ise^9,20, meme kanserleri ve pulmoner adenokarsinomlarda peritümöral makrofajların angiyogenezle ilişkisi olduğunu iddia etmektedir. Nakayama ve ark.’larının^19, kolorektal karsinomlarda tümör çevresi makrofaj infiltrasyonu ile anjiyogenez arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulmadığı halde, yüksek oranda makrofaj infiltrasyonu olan hastaların prognozlarının daha iyi olduğunu saptamıştır. Nakayama ve ark.’larının¹⁹ sonuçları bizim çalışmamızla tamamen çelişmektedir. Çünkü bizim çalışmamızda makrofaj infiltrasyonu ile anjiyogenez arasında anlamlı bir ilişki bulunurken, invazyon derinliği ve lenf nodu metastazı ile aralarında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunamamıştır. Bu durum ya kullanılan antikorları n farklılığından oluşmaktadır ya da olgularımızın erken evre kolorektal kanserleri içermemesi nedeniyle açıklanabilir.

Eozinofil lökositlerin de birtakım anjiyogenik faktörler içerdiğine dair çalışmalar bulunmaktadır. Özellikle allerjik hastalıklarda eozinofil lökositlerden eksprese edilen VEGF, bFGF ve anjiyogenin’in, anjiogenez ile ilişkili olduğu iddia edilmektedir^13,25. Çalışmamızda eozinofil lökosit infiltrasyonu ile tümör anjiyogenezi, tümörün invazyon derinliği ve lenf nodu metastazı arasında anlamlı bir ilişki saptamadık. Daha önce kolorektal karsinomlarda eozinofil lökosit infiltrasyonu ile yapılan çalışmalarda, eozinofil lökosit infiltrasyonunun iyi prognostik kriter olduğu iddia edilmiştir^14,26-29. Ancak malign tümörlerde eozinofil lökosit infiltrasyonu ve anjiyogenez arasındaki ilişkileri araştıran sınırlı sayıda makale vardır.

NK hücreleri kemik iliği kökenli lenfositler olup enfekte hücreler ya da tümör hücrelerine karşı sitotoksik etki gösterebilirler¹⁰. NK hücrelerinin anjiyogenezle ilişkisini araştıran çalışmalarda, NK hücrelerinin VEGF eksprese ederek anjiyogeneze etki ettiği bildirilmektedir¹¹. Buna karşın Hayakawa ve ark.’ları.³⁰ ise çalışmalarında NK hücrelerinin anjiyogenezi inhibe ettiğini iddia etmektedirler. Çalışmamızda damar yoğunluğu ile NK hücre sayısı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulamamış olsak da, yüksek mikrodamar yoğunluğu içeren vakalarda NK hücre sayısını daha yüksek olarak gözlemledik. Bu bizim çalışmamızda NK hücrelerinin anjiyogenezi arttırdığı yönünde yorumlanabilir. Ayrıca çalışmamızda NK hücreleri ile invazyon derinliği ve lenf nodu metastaz durumu arasında anlamlı ilişki saptamadık. NK hücreleri, nonspesifik tümör immünitesinde görev almaktadırlar. Ancak NK hücreleri dolaşımdaki lenfositlerin %15’ini oluşturdukları için prognoza bir etkileri olmayabilir. Benzer bir şekilde yapılan bir çalışmada, özofagusun skuamöz hücreli karsinomunda, NK hücrelerinin prognoza etkilerinin olmadığı iddia edilmiştir³¹. Halbuki kolorektal karsinomlarda, gastrik karsinomlarda ve akciğerin skuamöz hücreli karsinomunda yapılan çalışmalarda ise, NK hücre infiltrasyonu yoğun olan vakalarda prognozun daha iyi olduğu gösterilmiştir^32-34.

İnflamatuar hücrelerin kendi aralarındaki ilişkilere bakacak olursak, peritümöral makrofaj sayısı arttıkça NK hücrelerinin de arttığını gözlemledik. NK hücrelerinden salgılanan interferon-gama (IFN- ≡) makrofajları aktive edebilmektedir⁸. Yine Diefenbach ve ark.’nın¹⁰ da gösterdiği gibi tümör hücreleri ya da diğer uyaranlar NKG2D reseptörü sayesinde NK hücrelerini ve makrofajları aynı anda aktive edebilmektedir. Bizim çalışmamız da, bu doğrultuda çıkmıştır. Yine çalışmamızda, tümör çevresi NK hücresi ve eozinofil lökosit sayısı arasında pozitif bir korelasyon bulduk. Makrofajlar ve eozinofil lökositler arasında ise anlamlı bir ilişkiye rastlamadık.

Sonuç olarak çalışmamızda, kolorektal karsinomlarda, anjiyogenez ile prognostik parametrelerden invazyon derinliği ve lenf nodu durumu arasında anlamlı bir ilişki bulamadık. Bununla birlikte peritümöral inflamatuar hücre sayısı ile anjiyogenez arasında pozitif bir korelasyon olduğunu gösterdik. Çalışmamızdaki önemli noktalardan biri de, peritümöral inflamatuar hücrelerin birbirleriyle olan ilişkileridir. Bu çalışma anjiyogenezin çeşitli aşamalarında peritümöral inflamatuar hücrelerin birbirini tetikleyen etkileri olduğunu iddia etmektedir. Günümüzde kanser tedavisinde tümör immünitesine yönelik çalışmalar yoğun bir şekilde devam etmektedir. Çalışmamızın ileriye yönelik daha ayrıntılı çalışmalara ışık tutabileceği kanısındayız.

1) The gastrointestinal tract. In: Pathologic Basis of Disease, Kumar V, Abbas Abul K, Fausto N (ed). 7th ed, Philadelphia, Pennsylvania 2005, p 856-866.

2) Wendum D, Boelle VR, Rigau V, Sebbagh N, Olschwang S, Mourra N, et al. Mucinous colon cacinomas with microsatellite instability have a low microvessel density and lower vascular endothelial growth factor expression. Virchows Arch 2003; 442: 111-117.

3) Cassano A, Bagala C, Battelli C, Schinzari G, Quirino M, Ratto C, et al. Expression of vascular endothelial growth factor, mitogen activated protein kinase and p53 in human colorectal cancer. Anticancer Res 2002; 22: 2179-2184.

4) Leek RD, Hunt NC, Landers RJ, Lewis CE, Royds JA, Haris AL. Macrophage infiltration is associated with VEGF and EGFR expresion in breast cancer. J Pathol 2000; 190: 430-436.

5) Shimura S, Yang G, Ebara S, Wheeler TM, Frolov A, Thompson TC. Reduced infiltration of tumor-associated macrophages in human prostate cancer: association with cancer progression. Cancer Res 2000; 60; 5857-5861.

6) Hashimoto I, Kodama J, Seki N, Hongo A, Miyagi Y, Yoshinouchi M et al. Macrophage infiltration and angiogenesis in endometrial cancer. Anticancer Res 2000; 20: 4853-4856.

7) Ohno S, Inagawa H, Soma GI, Nagasue N. Role of tumor associated macrophage in malignant tumors: should the location of the infiltrated macrophages be taken into account during evaluation? Anticancer Res 2002; 22: 4269-4276.

8) Bingle L, Brown NJ, Lewis CE. The role of tumor associated macrophages in tumour progression: implication for new anticancer therapies. J Pathol 2002; 196: 254-265.

9) Leek RD, Lewis CE, Whitehouse R, Greenall M, Clarke J, Haris AL. Association of macrophage infiltration with angiogenesis and prognosis in invasive breast carcinoma. Cancer Res 1996; 56: 4625-29.

10) Diefenbach A, Hsia JK, Hsiung MYB, Raulet DH. A novel ligand for the NKG2D receptor activates NK cells and macrophages and induces tumor immunity. Eur J Immunol 2003; 33: 381-391.

11) Chen WS, Kitson RP, Goldfarb RH. Modulation of human NK cell lines by vascular endothelial growth factor and receptor VEGF-1. In vivo 2002; 16: 439-445.

12) Li XF, Charnock-Jones DS, Zhang E, Hiby S, Malik S, Day K, et al. Angiogenic growth factor messenger ribonucleic acids in uterine naturel killer cells. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86(4): 1823-1834.

13) Puxeddu I, Ribatti D, Crivellato E, Levi-Schaffer F. Mast cells and eosinophils: A novel link between inflammation and angiogenesis in allergic diseases. J Allergy Clin Immunol 2005;116(3):531-536.

14) Fisher ER, Paik M, Rockette H, Jones J, Caplan R, Fisher B. Prognostic significance of eosinophils and mast cells in rectal cancer. Hum Pathol 1989; 20: 159-163.

15) Bethwaite PB, Holloway LJ, Yeong ML, Thornton A. Effect of tumour associated tissue eosinophilia on survival of women with stage IB carcinoma of the uterine cervix. J Clin Pathol 1993; 45: 1016-1020.

16) Leighton SE, Teo JG, Leung SF, Cheung AY, Lee JC, Van Hasselt CA. Prevalance and prognostic significance of tumor associated tissue eosinophilia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer 1996; 77: 436-444.

17) Cooper SH. Intestinal neoplasms. In: Sternberg’s Diagnostic Surgical Pathology. Mills SE, Carter D, Reuter V, Greenson JK, Stoler MH, Oberman HA (eds). 4th ed. Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia. 2004, p1573.

18) Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma. N Eng J Med 1991; 324: 1-8.

19) Nakayama Y, Nagashima N, Minagawa N, Inoue Y, Katsuki T, Onitsuka K, et al. Relationships between tumor associated macrophages and clinicopathological factors in patients with colorectal cancer. Anticancer Res 2002; 22: 4291-4296.

20) Takanami I, Takeuchi K, Kodaira S. Tumor associated macrophage infiltration in pulmonary adenocarcinoma: Association with angiogenesis and poor prognosis. Oncology 1999; 57: 138-142.

21) Khorana AA, Ryan CK, Cox C, Eberly S, Sahasrabudhe DM. Vascular endothelial growth factor, CD68 and epidermal growth factor receptor expression and survival in patients with stage 2 and stage 3 colon carcinoma. Cancer 2003; 97: 960-967.

22) Barbera-Guilem E, Nyhus JK, Wolford CC, Friece CR, Sampsel JW. Vascular endothelial growth factor secretion by tumor infiltrating macrophages essentially supports tumor angiogenesis, and IgG immune complexes. Cancer Res 2002; 62: 7042-7049.

23) Eerola AK, Soini Y, Paakko P. A high number of tumor infiltrating lymphocytes are associated with small tumor size, low tumor stage and a favorable prognosis in operated small cell lung carcinoma. Clin Cancer Res 2000; 6: 1875-1881.

24) Tataroğlu C, Kargı A, Özkal S, Eşrefoğlu N, Akkoçlu A. Association of macrophages, mast cells and eosinophil leukocytes with angiogenesis and tumor stage in nonsmall cell lung cancer. Lung Cancer 2004; 43: 47-54.

25) Hoshino M, Takahashi M, Aoike N. Expression of vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, and angiogenin immunoreactivity in asthmatic airways and its relationship to angiogenesis. J Allergy Clin Immunol 2001; 107: 295-301.

26) Pretlow TP, Keith ET, Cryar AK, Bartolucci AA, Pitts AM, Pretlow TG, et al. Eosinophil infiltration of human colonic carcinomas as a prognostic indicator. Cancer Res 1983; 43: 2997-3000.

27) Shunyakov L, Ryan CK, Sahasrabudhe DM, Khorani AA. The influence of host response on colorectal cancer prognosis. Clin Colorectal Cancer 2004; 4(1): 38-45.

28) Fernandez-Acenero MJ, Galindo-Gallego M, Sanz J, Aljama A. Prognostic influence of tumor-associated eosinophilic infiltrate in colorectal carcinoma. Cancer 2000; 88(7): 1544-1548.

29) Nielsen HJ, Hansen U, Christensen IJ, Reimert CM, Brunner N, Oesgaard F. Independent prognostic value of eosinophil and mast cell infiltration in colorectal cancer tissue. J Pathol 1999; 189(4): 487-495.

30) Hayakawa Y, Takeda K, Yagita H, Smyth MJ, Van Kaer L, Okumura K, et al. IFN-gamma mediated inhibition of tumor angiogenesis by naturel killer T-cell ligand, alpha-galactosylceramide. Blood 2002; 100(5): 1728-1733.

31) Cho Y, Miyamoto M, Kato K, Fukunaga A, Shichinohe T, Kawarada Y, et al. CD4+ and CD8+ T cells cooperate to improve prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res 2003; 63: 1555-1559.

32) Coca S, Pigueras JP, Martinez D, Colmenarejo A, Saez MA, Vallejo C, et al. The prognostic significance of intratumoral natural killer cells in patients with colorectal carcinoma. Cancer 1997; 79: 2320-8.

33) Ishigami S, Natsugoe S, Tokuda K, Nakajo A, Che X, Iwashige H, et al. Prognostic value of intratumoral natural killer cells in gastric carcinoma. Cancer 2000; 88: 577-83.

34) Villegas FR, Coca S, Villarubia VG, Jimenez R, Chillon MJ, Jareno J, et al. Prognostic significance of tumor infiltating NK cells subset CD57 in patients with squamous cell lung carcinoma. Lung Cancer